干货满满二代测序 RNA 完整性检测常见问题最强攻

更新时间:2020-12-09 07:56
 

反恐精英CSGO竞猜-上[竞技宝]JJB Ambion的操作手册中讲到,RNA的完整性对GLOBIN清除步骤以及下游应用的成功至关重要,即使是中等水平的RNA降解也会导致捕获试剂在清除球蛋白mRNA时的不充分 血液样本的保存、RNA纯化的

  Ambion的操作手册中讲到,RNA的完整性对GLOBIN清除步骤以及下游应用的成功至关重要,即使是中等水平的RNA降解也会导致捕获试剂在清除球蛋白mRNA时的不充分

  血液样本的保存、RNA纯化的方法以及残留RNA酶的活性都会影响RNA的质量

  为保证RNA的质量,Illumina的产品手册中要求RIN值要大于8,华大根据交付样本的大数据分析,建议交付的样本的RIN值大于7(关于RIN值的标准,用户可以根据现实研究经验进行设定)

  为了研究如何将全国各地的样本安全送到样本库而免受人为因素的干预,挪威公众健康中心除了对合适的采血管、最佳/次优的采血体积进行讨论以外,还分析了来自全国各地样本的表达谱差异1:

  对6个有代表性的与癌症发生相关的基因进行RT-PCR并分析其转录本的变化

  研究结果是RNA质量未受运输过程的影响,关键基因的转录本的表达模式没有发生显著变化

  这种通过RIN值检测RNA完整性,结合RT-PCR检测关键基因转录本稳定性的方法,可以更全面的评估RNA的质量,特别是可用于研究样本是否适用于下游表达谱。

  慢粒白血病的靶向药格列卫靶向融合基因BCR-ABL因前段时间热映的影片《我不是药神》而走入大众视野中。有研究表明在BCR-ABL阳性患者中有不到80%的患者同时也存在ABL-BCR融合。在梅奥诊所的研究中提到,当样本RIN值为10时,测序可以同时检测到两种融合产物,而当RIN值为7以下时就检测不到BCR-ABL了2。

  从梅奥诊所的这项研究结果可以推断出两个融合位点距离3’端是有差异的,而事实上的确如此,BCR-ABL距离3’端5kb,ABL-BCR融合距离3’端只有1.5kb(图2, b)。将整个测序数据平铺在转录本上,横坐标是融合位点与3’末端的距离,纵坐标是覆盖的reads深度。结果显示:

  只有当RIN值为10时,几乎可以实现对距离3’端0-5kb区域的均匀覆盖(图2, c)

  一旦RIN值小于10,就很难覆盖到距离3’端大于2kb的区域了(图2, c)

  当RIN为3时,即使距离3’端1.5kb的ABL-BCR也不能被很好的覆盖(图2,d)

  人癌症变异(COSMIC)数据库中,目前已知的融合基因产物的融合位点距离3’端的中位数为2.7kb,大约有20%融合位点距3’端大于5kb、5%距3‘ 端大于7kb

  RIN值小于10时,难以测到距离大于2kb的融合位点。也就是说当RIN值小于10时,至少有超过20%的融合基因的产物无论测多少深度都是测不到的

  图2.从这张PPT里可以看出,距离转录本3’端更近的ABL-BCR更容易被检测到;只有当RIN值为10时,可以对距离3’端1-5kb区域实现均匀覆盖;当RIN值小于10,就很难覆盖到距离3’端大于2kb的区域。

  在以PolyA钓取为主要技术手段研究编码RNA时,RIN只能做为评估基本样本完整性的方法,而不能预测表达谱数据的可信度

  在两组独立的实验中,实验1将人标准参照(UHR)处理成不同RIN值的梯度,针对不同基因位点的测序结果做散点检测,分别以基因位点距转录本3’端的距离和检测灵敏度(有效reads数)作为横坐标和纵坐标3。结果发现RIN值相同(7.5)的两个不同样本在做散点图时,一个的曲线更拟合于RIN值为8.6的UHR,另一个更拟合于RIN值为5.9的UHR样本(图3)。实验2对健康志愿者的外周血分离单核细胞进行研究,在室温下静置不同时间(形成不同降解程度),纯化后进行以PolyA为技术手段的转录组测序4。对结果进行聚类分析,维度一为处理方案,即静置时间,维度二为样本的RIN值。在聚类结果中发现,聚类依据更多的与样本处理方案相关,而非RIN的差异(图4)。

  1.RIN 值可以作为评估基本样本完整性的方法,但不能预测某一个特定基因的完整性,这种情况下测序数据是样本完整性较为客观的反映

  图3.两个RIN值相同的不同样本,它们的表达谱数据与标准对照的聚类结果并不相同。

  加拿大的研究者在严格控制的实验环境下(没有核酸酶污染),以不同起始量的总RNA构建测序文库,并对总RNA进行处理,获得RIN值从9-2的样本5。测序结果表明:

  1.RNA测序鉴定到的小RNA的数目与建库时所用的起始总RNA量没有显著关系

  2.RNA测序数据的可利用程度(用于鉴定小RNA)与RIN值没有显著关系

  3.以全血为实验材料时,小RNA具有极高的稳定性,样本RIN值低也可以做小RNA测序,并且小RNA的定量结果是很可靠的

  另一项研究发表在Nature Biotechnology上,研究者在全美选择了9个技术过硬的实验室,用4家主流的RNA-Seq试剂盒(实验方案),对体液的小RNA-Seq结果展开对比6。图5中,三百多条合成序列(浓度设定已知)分为A组和B组。结果显示:

  1.聚类的结果只与建库的方法有关,如果建库方法不同则同一实验室同一样本的结果也不一致

  2.当只关心小RNA的差异表达时,最右侧的结果显示不同方法与实验室之间具有很好的可比性

  3.当以血清样本替换合成样本时,结果一致。说明以血清为代表的液体活检,当只关注小RNA的差异表达时,结果具有很好的重复性和再现性。

  图5.结果显示,相同的实验方法之间更强的相关性;与之相对的是,当分析A与B的相对值时,使用相同实验方法的不同实验室显示出非常高的相关性,并且即使在不同方法间也显示出高度的相关性。这说明相对定量对实验方法的差异有更好的包容性。

  Illumina推荐使用DV200来评估RNA是否可用于转录组测序,他们认为DV200大于30%,即总RNA中大于200nt的组分占比大于30%时是可以用于转录组测序的。

  针对不同完整性的FFPE样本,我们可以通过选择不同的实验方案来实现对样本内核酸信息的最大限度挖掘

  诺华制药生物医学研究所针对不同样本用量、不同降解程度以及不同RNA实验方法设计了一个宏大实验方案,用于评价最优的建库方案(图6)7。基本从五个维度进行了全面的评价:

  4.对于已知的基因,其定量的结果是否准确,例如与QPCR的方法或其它方法学的结果相比较

  这篇文章的结论是:在应对不同起始量、不同RNA完整程度的样本时,不同的建库方案都有各自的优缺点;但针对不同完整性的样本,我们可以通过选择不同的实验方案来实现对样本内核酸信息的最大限度挖掘。文章提到,当使用TruSeq的建库方法,即使样本只有5ng时,其测序结果也不错;而对于严重降解的样本,文章认为Access的方法可能是更好的选择。

  图6.对不同样本用量和降解程度的样本,以三种不同实验方案进行RNA测序,得出的比较结果与建议。

  希望以上这些华大专家的建议和安捷伦对RNA质控的经验与理解,可以帮助您更好的应用与实践二代测序RNA完整性检测。